光动力治疗与VP3基因联合治疗鼻咽癌的疗效研究

【摘要】光动力治疗(Photodynamictherapy,PDT)是采用一定波长的光照射蓄积于肿瘤细胞内的光敏剂,发生光物理化学反应,产生单态氧和自由基等其他活性物质、破坏肿瘤微血管、增强机体免疫力,促进细胞凋亡以杀伤肿瘤细胞的一种非手术治疗方法。然而PDT是对氧的依赖性及治疗深度的局限性限制其在肿瘤治疗中的广泛应用。近年来,随着基因治疗日益成为治疗肿瘤的最有前景的手段之一,PDT与基因治疗有机结合形成的PDT/基因治疗可能是一种治疗肿瘤的崭新策略。本文将分章讨论自杀基因VP3对鼻咽癌细胞的杀伤作用及体外体内实验验证PDT联合自杀基因VP3治疗鼻咽癌的疗效。第一章自杀基因VP3对鼻咽癌CNE-2细胞生长、增殖及凋亡的影响目的体外实验研究VP3基因其对鼻咽癌细胞CNE-2生长、增殖、凋亡的影响,以求证实VP3对鼻咽癌细胞的凋亡诱导效应。方法采用脂质体转染法将构建的PcDNA3.1(-)VP3-Myc(PVP3)及对照空载体质粒PcDNA3.1(-)转染鼻咽癌CNE-2细胞。通过荧光显微镜观察质粒转染效率,CCK-8法检测细胞生存率,RT-PCR、Westernblot法检测VP3表达效果,通过AnnexinV检测VP3对细胞凋亡的影响。结果1.VP3mRNA在野生型及空载体质粒转染组细胞中均无明显表达,在PVP3质粒转染组中有明显表达,相对表达量约1.27±0.24。VP3蛋白(apoptin)在野生型及空载体质粒转染组细胞中均无明显表达,在PVP3质粒转染组中有明显表达,相对表达量约0.22±0.06。2.空载体质粒转染组在24h、48h、72h细胞存活率分别为97.6±1.4%,94.2±1.7%、92.3±2.1%；PVP3质粒转染组在24h、48h、72h细胞存活率分别为79.7±3.6%,61.5±2.3%、52.4±3.8%。PVP3质粒转染与空载体质粒转染组比较有明显统计学差异(P<0.001)。3.空载体质粒转染组在24h、48h、72h细胞凋亡率分别为4.5±1.2%、5.1±0.8%、5.7±1.4%；PVP3质粒转染组在24h、48h、72h细胞凋亡率分别为11.6±2.4%、17.8±1.4%、27.3±3.3%。PVP3质粒转染与空载体质粒转染组比较有明显统计学差异(P<0.001)。结论成功建立了VP3基因稳定表达的鼻咽癌CNE-2细胞株,体外实验证实了VP3能明显抑制鼻咽癌CNE-2细胞的生长增殖,并能促进CNE-2细胞的凋亡,为后续实验提供了研究依据第二章光动力治疗联合VP3基因治疗对鼻咽癌CNE-2细胞的体外实验研究目的拟对VP3联合PDT对鼻咽癌CNE-2细胞进行体外实验研究,以证实VP3联合PDT对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效果。方法稳定表达VP3基因的鼻咽癌细胞CNE-2及对照组细胞分别接受不同能量密度的PDT治疗,CCK-8法检测细胞生存率,AnnexinV法、Tunnel法检测细胞凋亡。结果1.不同能量密度的PDT处理后,PVP3组细胞存活率明显低于空载体质粒转染组细胞,实验组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下生存率分别为0.533±0.036、0.312±0.027、0.171±0.032；对照组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下生存率分别为0.816±0.058、0.570±0.044、0.308±0.047,两组比较有明显统计学差异(P<0.001)。2.AnnexinV检测显示PVP3组细胞凋亡率明显高于空载体质粒转染组细胞,实验组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下凋亡率分别为0.363±0.025、0.672±0.043、0.741±0.039；对照组细胞在1、3、6.25J/cm2能量密度下凋亡率分别为0.266±0.027、0.568±0.055、0.671±0.046,两组比较有明显统计学差异(P<0.001)；Tunnel法检测显示实验组细胞中大部分细胞膨胀,细胞核碎裂,对照组细胞膜较完整,部分细胞呈空泡状,细胞核浓缩,呈块状,少量细胞细胞核碎裂。结论细胞实验研究发现与单纯PDT相比,PVP3+PDT联合治疗能显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞的生长增殖,并且能显著增强鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡。第三章VP3联合光动力治疗对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤作用的实验研究目的动物实验中比较VP3联合PDT与单纯PDT或VP3基因治疗对鼻咽癌的疗效,以进一步证实VP3联合PDT对鼻咽癌的高效杀伤效果。方法构建裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型,PDT处理后,测量并记录肿瘤的大小、重量;HE染色比较各组移植瘤病理学特点；免疫组化检测移植瘤中apoptin的表达。结果1.空载体质粒组、PVP3质粒组、CNE2/Mock+PDT和CNE2/VP3+PDT处理后0、3、7、14天时分别比较四组肿瘤体积,经ANOVA方差分析,四组间肿瘤体积差异有显著性意义,经两样本独立t检验方法进行两两比较,结果显示CNE2/VP3+PDT处理组肿瘤体积与其他各组相比明显减小(P<0.001)；且CNE2/VP3组肿瘤体积较CNE2/Mock组明显减小(P<0.001)。2.四组移植瘤重量差异有显著性意义,经LSD方法进行两两比较,CNE2/VP3+PDT处理组移植瘤重量与各对照组相比明显减小(P<0.001);CNE2/VP3组移植瘤重量较CNE2/Mock组明显减小(P<0.001)。3.HE染色检查发现CNE2/Mock组移植瘤肿瘤细胞形态正常,瘤体内见毛细血管丰富,未见明显坏死组织；CNE2/VP3组移植瘤肿瘤细胞形态正常,可见少许坏死区域；CNE2/Mock+PDT组移植瘤见大量肿瘤细胞变性及核固缩,伴有部分片状坏死区域；CNE2/VP3+PDT组移植瘤见大片状坏死区域,仅少量癌细胞岛残留。4.免疫组化检查发现CNE2/Mock组及CNE2/Mock+PDT组未见明显apoptin蛋白表达；CNE2/VP3组及CNE2/VP3+PDT组apoptin蛋白强表达,且其主要在细胞核中表达。结论利用基因治疗或者光动力治疗均能抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长,而光动力治疗联合基因治疗较单纯的光动力治疗或基因治疗对鼻咽癌裸鼠移植瘤有更好的杀伤效果。光动力治疗联合基因治疗为鼻咽癌的临床治疗提供了实验基础。
【作者】方小勇；
【导师】赵素萍；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】VP3；基因克隆；稳定转染；细胞凋亡；CCK-8；AnnexinV；PDT；AnnexinV法；Tunnel法；联合治疗；移植瘤；免疫组化；apoptin；

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